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Comité Editorial del Número
Contribuciones del Volumen 41, Número 4
por Mauricio Montero Astúa, Izayana Sandoval Carvajal, Lisela Moreira Carmona, William Villalobos Muller, Laura Garita Salazar, Sofía Carvajal Rojas
Aceptado: 15/12/2023 – Publicado: 30/12/2023 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2023-3
Resumen Antecedentes/Objetivo. Las hojas del arbusto de chaya (Cnidoscolus aconitifolius) o árbol espinaca, o chicasquil (en Costa Rica), son parte de la tradición culinaria Mesoamericana, con origen en el sur de México y Guatemala. El objetivo de este trabajo fue verificar la naturaleza viral de la enfermedad de una planta de chaya con mosaico detectada e identificar la especie del virus.
Materiales y Métodos. La detección viral se realizó mediante TEM, RT-PCR y secuenciación parcial empleando imprimadores degenerados para potexvirus. Se realizaron pruebas de patogenicidad mediante inoculaciones mecánicas empleando plantas de Nicotiana benthamiana y de chaya.
Resultados. Se reporta la detección del CsCMV en una planta de chaya con síntomas de mosaico. La patogenicidad y asociación del virus con los síntomas se demostraron mediante su inoculación en Nicotiana benthamiana y en plantas de chaya. Nuestra hipótesis es que corresponde a una introducción reciente del virus y se discute cómo las tradiciones culturales influyen en la distribución de los virus de plantas.
Conclusión. Los hallazgos confirman la presencia de un virus relacionado al CsCMV, previamente no informado para Costa Rica, en Cnidoscolus aconitifolius. En este trabajo resaltan la necesidad de estudiar su distribución y diversidad a través de Latinoamérica
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Figura 1. Muestra de chaya (Cnidoscolus aconitifolius) 20.222, tentativamente var. ‘Estrella’, con síntomas de
Figura 2. Observaciones por microscopia electrónica de transmisión de tejido foliar de chaya (Cnidoscolus aconitifolius) con síntomas de mosaico detectada en Costa Rica. Daño observado en los cloroplastos (ch), con pérdida de su forma típica y de los tilacoides, además de una inclusión bandeada (IB), como las asociadas con potexvirus (A). Detalle de la IB (B). N: núcleo, V: vacuola
Figura 3. Phylogenetic analysis of partial replicase ORF (618 nucleotides) of Cassava common mosaic virus (CsCMV). Gray shaded isolates from chaya (Cnidoscolus aconitifolius) host; black shaded the Costa Rica chaya isolate, and in bold the sequence of CsCMV in cassava (Manihot esculenta) reported as from Costa Rica. Virus isolates codes: GenBank accession number, isolate identification and three-letter country codes. Maximum likelihood analysis with Tamura-Nei and Gamma distribution model with 2000 replications (bootstrap method) in MEGA X
Cuadro 1. Chaya (Cnidoscolus aconitifolius) samples evaluated for viral symptoms and sources of stem cuttings
por Erika J. Zamora Macorra, Katia Aviña Padilla, Rosemarie W Hammond, Daniel L. Ochoa Martínez
Aceptado: 24/11/2023 – Publicado: 23/12/2023 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2023-5
Resumen Antecedentes/Objetivo. El virus del fruto rugoso marrón del jitomate (ToBRFV) ha surgido como una amenaza significativa para los cultivos de la familia Solanaceae, incluidos el tomate y el pimiento. Su presencia en México desde 2018 ha generado preocupación sobre su impacto en la producción agrícola. La detección temprana y precisa de este patógeno es crucial para prevenir su propagación y mitigar sus efectos. En México, se emplean varias técnicas moleculares para su diagnóstico, incluyendo RT-PCR convencional, RT-qPCR y RT-qPCR multiplex.
Materiales y Métodos: El objetivo de esta investigación fue evaluar la eficiencia de diferentes métodos de extracción de ARN en combinación con oligonucléotidos PCR específicos para la detección de ToBRFV.
Resultados. Entre los métodos probados, el protocolo de extracción de ARN CTAB-Trizol combinado con PCR anidada utilizando oligonucleótidos reportados por Dovas et al. (2004) se identificó como el método molecular más sensible para detectar el virus.
Conclusión. Este hallazgo destaca la importancia de seleccionar la combinación adecuada de protocolos de extracción y amplificación para lograr la sensibilidad y precisión óptimas en la detección de ToBRFV. Palabras clave: Virus del fruto rugoso marrón del jitomate, ToBRFV, cultivos de Solanaceae, extracción de ARN, RT-PCR, detección molecular, producción agrícola.
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Figura 1. A-C) En plantas de jitomate saladette recolectadas en invernaderos, se observaron síntomas evidentes de mosaico, deformación foliar y estrechamiento de las hojas. Estas plantas dieron positivo para el virus del fruto rugoso marrón del jitomate (ToBRFV). D-E) Las observaciones visuales en hojas inoculadas de Nicotiana revelaron la presencia de lesiones cloróticas y necróticas localizadas causadas por la infección con ToBRFV. Las plantas utilizadas para el estudio y que resultaron positivas al virus provinieron de Tecomán, Colima, México.
Figura 2. La evaluación de los métodos de extracción de ARN total implicó la comparación de su eficacia y rendimiento, medidos a través de lecturas de absorbancia en un espectrofotómetro Nanodrop 2000®. De los métodos probados, que incluyeron Trizol®, CTAB 2 % y CTAB 2 %-Trizol®, el protocolo CTAB 2 %-Trizol® demostró producir la concentración más elevada de ARN total, mientras que el kit de aislamiento de ARN resultó en la concentración más baja. Estos datos fueron registrados mediante mediciones de absorbancia a longitudes de onda de 260/280 y 260/230. El Nanodrop 2000® se utilizó para cuantificar la concentración de ARN extraído y evaluar su calidad a través de estas relaciones de absorbancia. Los resultados señalan que el protocolo CTAB 2 %-Trizol® fue especialmente efectivo en la extracción de ARN de alta calidad de las muestras de plantas, lo que lo convierte en una opción adecuada para análisis moleculares posteriores
Figura 3. Evaluación y sensibilidad de los oligonucleótidos PCR. Análisis electroforético en geles de agarosa al 1.5 % de los productos de RT-PCR y RT-PCR anidada (tamaño esperado de los oligonucleótidos de Ling 842 pb; tamaño esperado de los oligonucleótidos de Rodríguez-Mendoza 475 pb; tamaño esperado de los oligonucleótidos de Dovas 400 pb). (-): agua esterilizada en lugar de ARN. 100pb= 100pb DNA Ladder (Invitrogen®). 1Kb= 1000 pb DNA ladder (Promega®). 10-3 y 10-4 = 0.001 y 0.0001 ng μL-1
Cuadro 1. Oligonucleótidos probados en este estudio para la detección del ToBRFV en jitomate, tomatillo y berenjena
Cuadro 2. Comparación de referencias de oligonucleótidos, fuentes vegetales y límites de detección de ARN en la fuente de material vegetal infectado.
por Carlos D. Ramos Villanueva, Guadalupe Carrillo Benitez, Erika J. Zamora Macorra, Eduardo Santiago Elena, Samuel Ramírez Alarcón, Jezrael Jimenez Vidals, Ricardo Ricardo López
Aceptado: 30/11/2023 – Publicado: 19/12/2023 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2023-1
Resumen Antecedentes y objetivo: El Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) es uno de los principales patógenos del cultivo de jitomate en México. A pesar de los esfuerzos para evitarlo, es casi imposible por el bajo porcentaje de transmisión que tiene en semilla y la gran facilidad para ser transmitido mediante las labores culturales; por lo tanto, se buscan alternativas de manejo. Esta investigación tuvo como objetivo determinar el efecto de microorganismos endófitos aplicados al suelo, en plantas de jitomate infectadas por el ToBRFV.
Materiales y Métodos. Se utilizó una planta de jitomate como unidad experimental, con 13 repeticiones por tratamiento. Los tratamientos en plantas de jitomate infectadas con ToBRFV fueron Beauveria peruviencis, Trichoderma longibrachiatum, Pseudomonas sp. y agua como testigo enfermo; también se incluyó un tratamiento de plantas sanas tratadas con agua como testigo absoluto. Las variables respuesta fueron altura de la planta, peso fresco de la parte aérea y de la raíz y severidad (dos evaluaciones). Las mediciones se analizaron mediante pruebas HSD de Tukey-Kramer por cada par.
Resultados. Se encontraron diferencias significativas entre tratamientos: Beauveria peruviencis, Trichoderma longibrachiatum, Pseudomonas sp. y agua como testigo enfermo. El tratamiento que favoreció el desarrollo de las plantas infectadas (79 % más altas y 15 % con más peso que el testigo infectado) y disminuyó su severidad fue B. peruviencis, seguido de Pseudomonas sp. El tratamiento que provocó menor desarrollo de la planta (31% menos que el testigo infectado) e inclusive aumentó la severidad fue T. longichrachiatum
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Figura 1. A: plantas enfermas con ToBRFV a las que se les aplicó diferentes microorganismos y el testigo enfermo al que se le aplicó solo agua. B: plantas sanas, utilizadas como testigo. C: comparación entre plantas enfermas con ToBRFV tratadas con diferentes microorganismos y D: síntomas ocasionados por el ToBRFV, donde se observa el mosaico en hojas a los 20 días después de la inoculación (ddi) y la deformación de brotes a los 35 ddi.
Figura 2. Media de las variables respuesta, obtenidas al finalizar el experimento, por cada tratamiento aplicado en las plantas de jitomate infectadas con ToBRFV (enfermas) y sanas
Cuadro 1. Comparación de medias de las variables respuesta (altura, severidad y peso de planta de jitomate) registradas por cada tratamiento evaluado, y letras de unión generadas mediante la prueba HSD de Tukey-Kramer
por Erika Janet Zamora Macorra, Norma Ávila Alistac, Erika Lagunes Fortiz, Sergio de los Santos Villalobos
Aceptado: 12/12/2023 – Publicado: 28/12/2023 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2023-7
Resumen Los virus y viroides causan diversas enfermedades en jitomate (Solanum lycopersicum) en el mundo, generando pérdidas económicas importantes. Se han asociado alrededor de 312 virus y siete viroides, de los cuales más de 28 están presentes en México. Es necesaria la búsqueda de alternativas de manejo de estos fipatógenos, ya que la clásica eliminación de las primeras sintomáticas genera pérdidas de rendimiento, aunado a ello, la dificultad de evitar su diseminación. Por ello, el uso de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (RPCV), puede ser una alternativa efectiva para el manejo de virus y viroides. Los géneros Pseudomonas, Bacillus, Azospirillum, Anabena y Stenotrophomonas, se han implementado contra virus reportados en jitomate: Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Tomato mottle virus (ToMoV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Potato virus Y (PVY), Groundnut bud necrosis virus (GBNV), con beneficios en la disminución de incidencia y severidad hasta un 80 % y un aumento de rendimiento superior al 40 %. En México solo se ha utilizado Bacillus. Se vislumbra que el uso de RPCV es una estrategía que podría mitigar el impacto de enfermedades virales y viroidales, que se puede integrar a un manejo integrado.
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Figura 1. Estados de la República Mexicana donde se detectaron virus y viroides en jitomate (Ver Cuadro 1)
Figura 2. Principales formas de transmisión de los virus y viroides en jitomate. A) Transmisión por semilla; B) Transmisión mecánica, por uso de herramientas de trabajo, manipulación de las plantas; C) Transmisión por insectos vectores.
Figura 3. Síntomas asociados a virus y viroides en jitomate. A y B) Mosaico, reducción foliar, y deformación foliar leve y severa asociado a Tomato brown rugose fruit virus; C y D) Achaparramiento, deformación de frutos y coloración púrpura en hojas ocasionados por Mexican papita viroid; E) Síntoma de mosaico amarillento asociados a Pepino mosaic virus; F) Síntomas de achaparramiento, deformación y mosaico severo asociado a Begomovirus; G y H) Síntomas de anillos concéntricos y ligera deformación en fruto asociado a Tomato spotted wilt virus; I) Mosaico en hojas ocasionado por Tobacco mosaic virus.
Figura 4. Formas de aplicación y mecanismos de acción de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (RPCV) usadas para proteger al jitomate de infecciones virales
Cuadro 1. Principales virus reportados en jitomate (Solanum lycopersicum) en México y el mundo.
Cuadro 2. Viroides que afectan al jitomate (Solanum lycopersicum) en el mundo.
Cuadro 3. Especies de rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal usadas para manejo de virus en jitomate.
por Rubén Félix Gastélum, Gabriel Herrera Rodríguez, Karla Yeriana Leyva Madrigal, Guadalupe Arlene Mora Romero
Aceptado: 15/12/2023 – Publicado: 28/12/2023 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2023-4
Resumen Se abordan especies de arvenses y ruderales de las familias Cucurbitaceae, Solanaceae en el norte de Sinaloa, como potenciales fuentes de inóculo para el desarrollo del Tomato apex necrosis virus (ToANV), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Watermelon mosaic virus (WMV), (Papaya ring spot virus (PRSV-W) y (Cucumber mosaic virus (CMV). Se hace referencia al girasol silvestre como potencial fuente de inóculo para la cenicilla (Golovinomyces spadiceus); se incluyen también el tabaquillo para el tizón foliar (Alternaria spp.), el chichiquelite para la mancha de la hoja (Curvularia moehlemvekiae), el zacate Johnson para el tizón foliar (Alternaria sp.), la higuerilla silvestre para el tizón foliar y el meloncillo silvestre para el mildiú (Pseudoperonospora cubensis). Se proponen líneas futuras de investigación multidisciplinarias enfocadas a la determinación de la patogenicidad en plantas cultivadas de virus y hongos asociados a plantas silvestres y viceversa. También se deberá estudiar la distribución espacio-temporal de plantas silvestres que pue den fungir como fuentes de inóculo, así como la de potenciales insectos vectores de enfermedades virales. La implementación de herramientas moleculares modernas, como la Secuenciación de Alto Rendimiento, para la detección de fitopatógenos es importante. Todo esto contribuirá a la aplicación de estrategias amigables con el ambiente para el control de las enfermedades en cultivos agrícolas en Sinaloa, en beneficio de los productores de hortalizas.
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Figura 1. Síntomas inducidos por Tomato apex necrosis virus (ToANV). A) Necrosis de rama joven en jitomate; B) Necrosis en frutos de jitomate; C) clorosis intervenal en planta de tomatillo; D) Amarillamiento en brotes jóvenes de tomatillo silvestre (Physallis sp.); E) Amarillamiento leve y deformación de síntomas iniciales en chichiquelite (Solanum nigrum); F) Síntomas iniciales de clorosis intervenal; G) Clorosis intensa y enverdecimiento de nervaduras en hojas de tabacón (Nicotiana glauca); H) Amarillamiento general en mala mujer (Solanum asureum)
Figura 2. Síntomas inducidos por el virus Zucchini yellows mosaic virus (ZYMV). A) Amarillamiento en hoja de calabaza Zucchini grey; B) Síntomas de deformación de fruto del mismo hospedante causado por el mismo virus
Figura 3. Diferentes síntomas asociados a hongos en plantas silvestres. A) Lesiones de color café claro a oscuro y atizonamiento de la vaina de la hoja en plantas de zacate Johnson (Sorghum halepense), causadas por Curvularia muehlenbeckiae; B) Lesiones color café claro con círculos concéntricos en tabacón (Nicotiana glauca) causadas por Alternaria sp.; C) Síntomas de manchas foliares color café oscuro con anillos concéntricos causados por Alternaria sp. aislada de tabaco silvestre; D) Cenicilla causados por Golovinomyces spadiceos en hoja de girasol silvestre (Helianthus annus); E) Manchas irregulares y circulares café claro y márgenes de las hojas con atizonamiento causado por Alternaria riccini en hoja de higuerilla silvestre (Ricinus comunis) F) Síntomas de mildiú causados por Pseudoperonospora cubensis en meloncillo silvestre (Cucumis melo var. Dudaim)
Cuadro 1. Virus causantes de enfermedades en cucurbitáceas y en jitomate presentes en Sinaloa y otras regiones del mundo
El género Orthotospovirus en Costa Rica: Un caso centroamericano
por Mauricio Montero Astúa, Natasha Dejuk Protti, David Bermúdez Gómez, Elena Vásquez Céspedes, Laura Garita Salazar, Federico J. Albertazzi, Scott Adkins , Lisela Moreira Carmona
Aceptado: 10/12/2023 – Publicado: 28/12/2023 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2023-6
Resumen Antecedentes/Objetivo. El género Orthotospovirus, conocido por impacto significativo en una variedad de cultivos de importancia global, se manifiesta en virus emergentes con plantas económicamente perjudiciales. Aunque estos virus fitopatógenos están bien documentados en América del Norte y del Sur, su presencia y dinámica en América Central, particularmente en Costa Rica, un punto crítico entre los dos continentes, siguen siendo menos comprendidos. El objetivo de este trabajo fue determinar la prevalencia de los Orthotospovirus en Costa Rica y obtener secuencias parciales del genoma para analizar la variabilidad genética.
Materiales y Métodos. El estudio consistió en un análisis exhaustivo de 295 muestras de plantas utilizando el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), una técnica sensible para detectar antígenos específicos, para evaluar la prevalencia de INSV, IYSV, TSWV y el serogrupo GRSV/TCSV. Una caracterización molecular más profunda de 20 muestras se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), utilizando cebadores tanto de amplio espectro como específicos de especie para aumentar la precisión de la detección.
Resultados. Los resultados de ELISA revelaron la no detección de TSWV y el serogrupo GRSV/TCSV, divergiendo de informes de diagnóstico previos. La confirmación de INSV en Costa Rica a través de ELISA, RT-PCR y secuenciación parcial subraya su prevalencia tanto en campos abiertos como en invernaderos. A pesar de los informes diagnósticos anteriores que sugerían la presencia de TSWV en Costa Rica, nuestro estudio no detectó este virus. El análisis RT-PCR con cebadores degenerados tampoco encontró evidencia de otras especies de Orthotospovirus en nuestras muestras. La identificación de un haplotipo dominante de INSV, junto con tres variantes adicionales, sugiere la probabilidad de al menos dos introducciones independientes del virus en la región.
Conclusión. Estos hallazgos subrayan la necesidad de realizar muestreos e investigaciones más exhaustivas sobre los Orthotospovirus en América Central para comprender mejor su epidemiología e impacto en la agricultura
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![Figura 4. Gráfico de la Red de Haplotipos del Virus del anillado necrótico de la impatiens. Este gráfico representa una red de haplotipos inferida mediante el método TCS, basada en un alineamiento de secuencias de 261 bp del ORF de la proteína nucleocápside (segmento S[N]) del Virus del anillado necrótico de la impatiens. La red incluye datos de 81 aislados, representando visualmente las relaciones genéticas y la diversidad entre los diferentes haplotipos del virus.](img/RMF/Volumenes/NumEspeciales/VE4142023/RMF2023-6/Figure4.jpg)
![Figura 5. Análisis filogenético integral de aislados del virus del anillado necrótico de la impatiens. Esta figura muestra un árbol filogenético construido a partir de un alineamiento de secuencias concatenadas (2945 posiciones) que incluyen regiones del nucleocápside [S(N)], precursor de la glicoproteína [M(G)], proteína de movimiento [M(NSM)] y ORFs de la polimerasa viral [L(L)]. El árbol incluye aislados de varios países, identificados por códigos de tres letras según ISO 3166-1: CHN (China), ITA (Italia), KOR (Corea del Sur) y USA (Estados Unidos de América). Para los aislados de Costa Rica, códigos de letras adicionales y distintos entre paréntesis indican ubicaciones geográficas independientes. El análisis, realizado en MEGA X, utilizó el método de Máxima Verosimilitud con un modelo de parámetro Tamura-3 y una tasa de variación en nucleótidos distribuida gamma (+G), con 2000 permutaciones. La barra de escala indica el número de sustituciones de nucleótidos por sitio.](img/RMF/Volumenes/NumEspeciales/VE4142023/RMF2023-6/Figure5.jpg)
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Cuadro 4. Secuencias parciales nucleotídicas e identidad viral determinada para un subgrupo de muestras positivas por ELISA para INSV.
Figura 1. Representación de las posiciones de anillamiento de los pares de cebadores en referencia al genoma completo de Impatiens necrotic spot virus; números de accesión entre paréntesis para cada segmento del genoma. Traslape entre cebadores y secuencias finales parciales obtenidas en esta investigación (rectángulos grises) con el tamaño esperado (pb). Los valores de pares de bases debajo de cada cebador representan las posiciones del primer y último nucleótido en el genoma de referencia del amplicon correspondiente.
Figura 2. Síntomas diversos del virus del anillado necrótico de la impatiens (INSV) en múltiples huéspedes confirmados por ELISA, RT-PCR y secuenciación parcial. A: Anillos concéntricos necróticos en Impatiens (Impatiens sp.) T031. B, C: Anillos y manchas cloróticas en Boca de Dragón (Antirrhinum majus) T057. D: Estrías cloróticas y necróticas en hojas de orquídea T024. E, F: Mosaico clorótico en Amarilis (Hippeastrum sp.) T161 e Iris (Iris sp.) T184. G: Anillos concéntricos necróticos en Coleo (Plectranthus scuttellarioides) T157. H: Patrones cloróticos en Albahaca (Ocimum basilicum) T156. I, M: Patrones de anillos concéntricos cloróticos en hojas de Pimiento Dulce (Capsicum annuum) T250 y T092. J, K, L: Maduración irregular, patrones de anillos y deformación en frutos de Pimiento Dulce T092, T107, T094. N, O: Patrones cloróticos, anillos y superficie irregular en frutos de Tomate (Solanum lycopersicum) T263 y T303
Figura 3. Detección a largo plazo de los virus del anillado necrótico del Impatiens y del marchitamiento manchado del jitomate por ELISA. Este gráfico muestra la frecuencia de detección tanto del Virus del anillado necrótico de la Impatiens como del Virus del marchitamiento manchado del jitomate a lo largo de un período de 23.5 años (2000 a julio de 2023). Los datos, obtenidos de muestras enviadas a los servicios de diagnóstico del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica, ilustran las tendencias temporales y los patrones de ocurrencia de estos virus en Costa Rica.
Figura 4. Gráfico de la Red de Haplotipos del Virus del anillado necrótico de la impatiens. Este gráfico representa una red de haplotipos inferida mediante el método TCS, basada en un alineamiento de secuencias de 261 bp del ORF de la proteína nucleocápside (segmento S[N]) del Virus del anillado necrótico de la impatiens. La red incluye datos de 81 aislados, representando visualmente las relaciones genéticas y la diversidad entre los diferentes haplotipos del virus.
Figura 5. Análisis filogenético integral de aislados del virus del anillado necrótico de la impatiens. Esta figura muestra un árbol filogenético construido a partir de un alineamiento de secuencias concatenadas (2945 posiciones) que incluyen regiones del nucleocápside [S(N)], precursor de la glicoproteína [M(G)], proteína de movimiento [M(NSM)] y ORFs de la polimerasa viral [L(L)]. El árbol incluye aislados de varios países, identificados por códigos de tres letras según ISO 3166-1: CHN (China), ITA (Italia), KOR (Corea del Sur) y USA (Estados Unidos de América). Para los aislados de Costa Rica, códigos de letras adicionales y distintos entre paréntesis indican ubicaciones geográficas independientes. El análisis, realizado en MEGA X, utilizó el método de Máxima Verosimilitud con un modelo de parámetro Tamura-3 y una tasa de variación en nucleótidos distribuida gamma (+G), con 2000 permutaciones. La barra de escala indica el número de sustituciones de nucleótidos por sitio.
Cuadro 1. Muestras recolectadas en cinco provincias de Costa Rica para analizar la presencia de especies de Orthotospovirus.
Cuadro 2. Pares de cebadores y perfiles térmicos usados para la detección de Orthotospovirus.
Cuadro 3. Número total de muestras positivas por especie vegetal evaluadas por la técnica de ELISA para detectar tres Orthotospovirus en Costa Rica
Viroma del nopal verdura en la zona centro de México
por Candelario Ortega Acosta, Daniel L. Ochoa Martínez, Reyna I. Rojas Martínez, Cristian Nava Díaz, Rodrigo A. Valverde
Aceptado: 15/12/2023 – Publicado: 27/12/2023 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2023-2
Resumen Antecedentes/Objetivo. En este estudio se aprovechó la capacidad de la secuenciación de alto rendimiento (HTS) para detectar virus en nopal verdura.
Materiales y Métodos. Se analizaron muestras del Estado de México (EDMX), Hidalgo y Morelos, así como de la Ciudad de México (CDMX).
Resultados. En la muestra proveniente de EDMX, se detectaron y recuperaron los genomas de Opuntia virus 2 (OV2, género Tobamovirus) y Cactus carlavirus 1 (CCV-1, género Carlavirus). En la muestra proveniente de CDMX, además de OV2 y CCV-1, se detectó un nuevo viroide y un potexvirus. El primero tiene un genoma RNA circular con 412 nt de longitud para el cual se propone el nombre de “Opuntia viroid I” (OVd-I). La estructura primaria de este viroide mostró una identidad de secuencia de nucleótidos de menos del 80 % con cualquiera de los viroides actualmente conocidos y una relación filogenética con el género Apscaviroid, (Familia Pospiviroidae) con el que comparte motivos estructurales conservados.
Conclusión. El nuevo potexvirus se denominó Opuntia potexvirus A (OPV-A), cuya secuencia de la replicasa viral tiene un 77.7 % de identidad de aminoácidos con Schlumbergera virus X. Finalmente, en 93 (72 %) de 129 muestras de nopal verdura recolectadas en las cuatro entidades, se detectó al CCV-1.
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Figura 1. Síntomas asociados a virosis en cladodios de nopal verdura. (A-D) Muestras de nopal colectadas en la Ciudad de México, Alcaldía Milpa Alta, (E) Muestra de nopal colectado en el estado de México, Municipio de Otumba, (F) Muestra de nopal sana del Estado de México.
Figura 10. Árbol filogenético de Máxima Verosimilitud de la familia Alphaflexiviridae basado en las se- cuencias de aminoácidos de la cápside proteica; la secuencia de Opuntia virus A se encuentra en negrita. Los colores del árbol representan los diferentes géneros de esta familia. Los círculos en las ramas muestran valores de soporte UFBoot > 70 %
Figura 11. Estructura secundaria predicha utilizando el servidor web UNAFold (Herramienta UNAFold disponible online: www.mfold.org) para OVd-I. Se resaltan los sitios que forman la región conservada terminal (TCR) en las posiciones 16 a 26 y la región conservada central (CCR) en las posiciones 84 a 100 y 313 a 329.
Figura 12. Árbol filogenético de Máxima Verosimilitud de la familia Pospiviroidae y Avsunviroidae basado en secuencias de nu- cleótidos de genomas completos de las especies representativas de los diferentes géneros. La secuencia obtenida del OVd-I se encuentra en negrita. Los diferentes colores representan los géneros de viroides. Los círculos en las ramas muestran valores de soporte UFBoot > 50 %.
Figura 13. Distribución de frecuencia de identidades por pares obtenida con la herramienta de demarcación de secuencias SDT (Muhire et al., 2014) a partir de secuencias de genomas completos de especies de la familia Pospiviroidae para respaldar la demarcación del Opuntia viroid I, como una nueva especie
Figura 14. Partículas virales en forma de varilla rígida (®) y flexible (®) de diferentes longitudes observadas por microscopía electrónica de transmisión en plantas de nopal con patrones amarillos irregulares, anillos amarillos, mosaico y manchas cloróticas alrededor de las espinas, utilizando la técnica “leaf dip"
Figura 2. (A) Cobertura de lecturas a lo largo del genoma del aislamiento OV2-Edo-Mex y porcentaje del contenido de guanina citosina, (B) Mapa genómico del OV2-Edo-Mex. La flecha indica el sitio del codón de terminación de la proteína de 128 kDa completa, con fugas de lectura
Figura 3. (A) Cobertura de lecturas a lo largo del genoma del aislamiento OV2-CDMX y porcentaje del contenido de guanina citosina (B) Mapa genómico de OV2-CDMX. La flecha indica el sitio del codón de terminación de la proteína de 128 kDa completa, con fugas de lectura.
Figura 4. Árbol filogenético de Máxima Verosimilitud del género Tobamovirus que muestra las relaciones entre los genomas obtenidas en este estudio (en negrita) del OV2 y la de aislamientos previamente reportados. Los diferentes colores representan las familias botánicas como hospedantes naturales donde se ha repor- tado cada virus. Los círculos en las ramas muestran valores de soporte UFBoot > 70%.
Figura 5. (A) Cobertura de lecturas a lo largo del genoma del aislamiento CCV-1-Edo-Mex y por- centaje del contenido de guanina citosina, (B) Organización del genoma de CCV1-Edo- Mex, que muestra seis marcos de lectura abiertos y sus productos correspondientes. RNA- dependiente RNA-polimerasa, (RdRp); cubierta proteica, (CP); proteína de unión al ácido nucleico, (NB); bloque de tres genes, (TGB).
Figura 6. Árbol filogenético de Máxima Verosimilitud de genomas completos de secuencias de nucleótidos de CCV-1 de este estudio (en negrita), así como otros aislamientos, y diferentes especies del género Car- lavirus. Como grupo externo se utilizó al Apricot vein clearing associated virus, género Prunevirus. Los círculos en las ramas muestran valores de soporte UFBoot > 50%
Figura 7. (A) Cobertura de lecturas a lo largo del genoma de Opuntia potexvirus A (OPV-A) y por- centaje de guanina/citosina, (B) Organización del genoma de OPV-A, que muestra cinco marcos de lectura abiertos y sus productos correspondientes: RdRp, replicasa viral; TGB, bloque de tres genes. CP, cubierta proteica.
Figura 8. Matriz de identidad del porcentaje de aminoácidos de la cápside proteica (A) y la replicasa viral, (B) de las especies del género Potexvirus más cercanas al Opuntia potexvirus A (en negrita).
Figura 9. Árbol filogenético de Máxima Verosimilitud de la familia Alphaflexiviridae basado en las se- cuencias de aminoácidos de la replicasa viral; la secuencia del Opuntia virus A se encuentra en negrita. Los colores del árbol representan los diferentes géneros de esta familia. Los círculos en las ramas muestran valores de soporte UFBoot >70%
Cuadro 1. Iniciadores utilizados en los ensayos de RT-PCR para la validación de los virus/viroide detectados en los datos de HTS de las dos bibliotecas de nopal
Cuadro 2. Comparación del genoma completo o parcial de los virus encontrados por HTS en las dos bibliotecas de nopal, con la secuencia de referencia más similar del GenBank
Cuadro 3. Resultado del análisis Blastx de virus potencialmente presentes en la biblioteca CDMX-1 y confirmación por RT-PCR y secuenciación.
Cuadro 4. Detección de CCV-1 en cuatro estados productores de nopal verdura en México
