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Patosistema de Iris yellow spot orthotospovirus, hospederos del virus y el vector (Thrips tabaci)
por Norma Ávila Alistac, Erika J. Zamora Macorra, Héctor Lozoya Saldaña
Aceptado: 10/3/2024 – Publicado: 10/3/2024 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2310-8
Resumen Iris yellow spot Orthotospovirus (IYSV) causa graves problemas en el cultivo de cebolla (Allium cepa) y está ampliamente distribuido en las zonas productoras del país. En México se reportó en 2010 como “mancha amarilla” en cebolla y en otros miembros del género Allium. Su principal vector Thrips tabaci, que ocasiona daños directos por alimentación y por ser vector de otros virus como Tomato spotted wilt Orthotospovirus e Impatiens necrotic spot Orthotospovirus. El conocimiento del patosistema de IYSV-Thrips tabaci-Allium cepa-arvenses puede coadyuvar a un manejo integral y concientización del uso de pesticidas. La versatilidad de IYSV de infectar a más de 60 especies de plantas (>20 familias), de las cuales en su mayoría están presentes en México; aunado al amplio rango de hospedantes del vector, vuelve compleja la interacción y conlleva a comprender mejor sobre la diversidad de hospedantes alternos del vector y/o el IYSV. En la actualidad, información sobre arvenses como hospederos de IYSV y el vector es limitado, pero su conocimiento proporcionará mayor comprensión de la enfermedad. Es importante tener un conocimiento integral del virus, hospedante principal, hospedantes alternos y vector en el país, para encausar investigaciones futuras para contrarrestar este problema y minimizar pérdidas causadas por IYSV en el cultivo de cebolla principalmente.
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Figura 1. Representación de la organización segmentada del genoma de ARN de Iris yellow spot Orthotospovirus (L, M y S). Modificado de Bag et al. (2015).
Figura 2. A y B) Síntomas asociados a la infección de Iris yellow spot Orthotospovirus consistentes en lesiones cloróticas de color blanco pajizo en forma elongada; C y D) Lesiones cloróticas de color blanco pajizo con presencia de una isla verde en el centro de la lesión; E-G) Presencia de altas poblaciones de T. tabaci (inmaduros y adultos) en el cultivo de la cebolla.
Figura 3. Arvenses interaccionando dentro y fuera del cultivo de cebolla (Allium cepa). A) Escoba amarga (Parthenium hysterophorus); B) Verdolaga (Portulaca oleracea); C) Plantas de acalifa (Acalypha ostryifolia); D) Acahual o falso girasol (Tithonia tubiformis) en el borde del cultivo de cebolla.
Figura 4. Sistema epidemiológico de un patosistema viral encauzado a Iris yellow spot Orthotospovirus (basado y modificado de Madden et al., 2000). Acotaciones utilizadas: v(t)= Tasa de fecundidad total de la población del insecto por día dentro del cultivo. Ґ= Tiempo de incubación del virus dentro del vector. q= Probabilidad de que la descendencia del vector sea virulifera. β= Tasa de mortalidad de plantas y recuperación (resiembra). α= Tasa de mortalidad y natalidad del insecto. ɸb= (Plantas visitadas por insectos al día) (Probabilidad de que el insecto virulífero inocule al virus en una planta por una visita). 1/k1= Tiempo en que el vector inocula la planta. 1/k2= Periodo de latencia del virus en la planta. 1/k3= Periodo infeccioso del virus en la planta. ɸT= (Plantas visitadas por insectos al día) (Tiempo en que el insecto prueba la planta en una visita). Ex= Tasa de emigración de insectos libres de virus. Ix= Tasa de inmigración de insectos libres de virus. Ey= Tasa de emigración de insectos latentes. Ez= Tasa de emigración de insectos infectivos. Iy= Tasa de inmigración de insectos latentes. Iz= Tasa de inmigración de insectos infectivos. 1/λ = Tiempo de adquisición del vector. ɸa= (Plantas visitadas por insectos al día) (Probabilidad de que un insecto adquiera al virus con una sola visita a la planta infectada). 1/ƞ= Tiempo en que el virus pasa de latente a infectivo dentro del vector (periodo de latencia). Para mayor información consultar a Madden et al. (2000).
Cuadro 1. Rango de hospedantes de Iris yellow spot Orthotospovirus
por José Jesús Márquez Diego, Andrea Denisse Martinez Vidales, Errikka Patricia Cervantes Enríquez, Abraham Ruiz Castrejón, José Humberto Romero Silva, Maria Edith Ortega Urquieta, Fannie Isela Parra Cota, Sergio de los Santos Villalobos
Aceptado: 19/2/2024 – Publicado: 06/3/2024 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2402-9
Resumen Antecedentes/Objetivo. Bacillus es un género bacteriano cosmopolita con una gran diversidad genómica. Así, al explorar su genoma, es posible comprender más sobre los rasgos fisiológicos y bioquímicos involucrados en su control biológico contra fitopatógenos. El objetivo de este trabajo fue correlacionar las relaciones filogenómicas de las especies tipo del género Bacillus con la presencia de clústeres de genes asociados al control biológico de fitopatógenos, mediante la minería del genoma.
Materiales y Métodos. Con base en la literatura se han reportado 336 especies pertenecientes al género Bacillus; sin embargo, después de la reclasificación, se reconocieron un total de 123 especies tipo y se encontraron sus genomas en la plataforma EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/). Para este trabajo se utilizaron los índices relacionados al genoma completo (OGRIs), que indican qué tan similares son dos secuencias de un genoma. Luego, se utilizó la plataforma Realphy para crear el árbol filogenómico 1.13 (referencia del constructor de filogenia basado en acciones). Finalmente, la predicción de clústeres de genes biosintéticos (BGC) asociados con el control biológico de fitopatógenos se realizó utilizando antiSMASH v6.0 (https://antismash. secondarymetabolites.org/).
Resultados. La presente estrategia permitió correlacionar y predecir la capacidad de control biológico de las especies de Bacillus en estudio con base en su afiliación taxonómica ya que a una distancia evolutiva más corta a Bacillus subtilis indicó una alta capacidad potencial para producir compuestos de control biológico. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de que adquieran la capacidad de producir nuevos compuestos de biocontrol durante su separación evolutiva.
Conclusión. Este trabajo valida la correlación entre la filiación taxonómica de las especies de Bacillus estudiadas y su capacidad de control biológico, lo que es útil en la etapa de bioprospección para diseñar bioplaguicidas prometedores.
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Figura 1. Árbol filogenómico con las 123 especies de Bacillus tipo estudiadas, donde se identificaron dos grupos principales: i) B. megaterium (color rosa) y ii) B. subtilis (color azul)
Cuadro 1. Especies de cepa tipo pertenecientes al género Bacillus descargadas de la plataforma EzBioCloud, que fueron utilizadas en este estudio
por Alfonso Muñoz Alcalá, Gerardo Acevedo Sánchez, Diana Gutiérrez Esquivel, Oscar Bibiano Nava, Ivonne García González, Norma Ávila Alistac, María José Armenta Cárdenas, María del Carmen Zúñiga Romano, Juan José Coria Contreras, Serafín Cruz Contreras, Gustavo Mora Aguilera
Aceptado: 19/2/2024 – Publicado: 06/3/2024 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2312-1
Resumen Antecedentes/Objetivo. La investigación epidemiológica en Phaseolus coccineus es insipiente. El objetivo fue desarrollar y validar metodologías digitales para cuantificación de severidad asociada a la cenicilla polvosa en frijol ayocote.
Materiales y Métodos. Se seleccionó una parcela de frijol ayocote con 65.3 % de incidencia y 22.7 % de severidad promedio foliar de cenicilla polvosa. A partir de 250 foliolos colectados en campo con distintos grados de severidad, se diseñaron y validaron ocho escalas logarítmicas-diagramáticas (ELD) de 7 y 8-clases en entorno controlado (VEC) y campo (VCa). En Rstudio®, se determinó exactitud (β), precisión (R2), reproducibilidad (r), y concordancia con el índice kappa de Cohen (κw) y coeficiente de concordancia de Lin (LCC). Adicionalmente, se realizó un Hierarchical Cluster Analysis (HCA) por escala y entorno para agrupación por similitud de evaluación. Imágenes RGB-dron se procesaron en ArcMap® v10.3. En un bloque de 15-cuadrantes se realizó un análisis de ‘segmentación de imagen’ mediante clasificación supervisada y máxima probabilidad para estimar severidad de cenicilla y un indicador de cobertura de vigor (ICV).
Resultados. En VEC-1, escalas v1r2 (ELD-7c; β=1.07, R2=0.93, r=0.87) y v1r1 (ELD-8c; β=0.97, R2=0.85, r=0.87) resultaron mejor evaluadas. En VEC-2, comparando clústeres conformados en el HCA, ELD-7c fue la mejor evaluada con exactitud perfecta (β>0.96), precisión muy alta (R2>0.94), reproducibilidad muy alta (r=0.97–0.99) y concordancia muy buena (κw>0.96; LCC>0.97); y en ELD-8c disminuyó reproducibilidad y concordancia. En VCa, ELD-7c mantuvo métricas óptimas, pero ELD-8c alcanzó parámetros ideales para una ELD preventiva en etapas iniciales de la cenicilla polvosa (β>0.98, R2>0.98, r=0.99, κw=0.99–0.999, LCC=0.98–0.999). El análisis de imagen RGB-drone estimó severidad = 8.4 % (CI = 5.3 – 12.6 %) e ICV = 0.88 (CI = 0.76 – 0.99), contrastante con la evaluación de campo 47 % (CI = 38.8 – 55.3 %) y 0.46 (CI = 0.76 – 0.99), respectivamente, principalmente con ICV>0.94 debido a menor exposición de hojas sintomáticas. Sugiere aplicabilidad para estimaciones de vigor y con restricciones para severidad en función de expresión patogénica.
Conclusión. Se propone una metodología para desarrollo de ELD integrada por: toma, procesamiento y cuantificación de imágenes; validación controlada y campo. Estadísticos de validación incluyeron precisión (R2); exactitud (β); reproducibilidad (coeficiente de Pearson y Hierarchical Cluster Analysis); y concordancia (Co-eficiente de Lin e Índice de Kappa), propuestos por primera vez de manera integral. Se proponen imágenes RGB-drone para estimar un índice de cobertura de vigor y severidad integral.
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Figura 1. Versiones finales de escalas logarítmicas-diagramáticas de severidad foliar para cenicilla en frijol Ayocote (Phaseolus coccineus), seleccionadas para validación en campo. Escalas logarítmicas-diagramáticas de A) 7 clases; B) 8 clases.
Figura 2. A1 y B1. Escala logarítmica-diagramática de 7 y 8 clases para evaluación de severidad de cenicilla en foliolos de frijol Ayocote (P. coccineus), durante el proceso de Validación en Entorno Controlado (VEC) de 30 hojas por nueve evaluadores. A2 y B2. Heatmap del coeficiente de correlación de Pearson (r) entre nueve evaluadores por escala de severidad. Los valores de r = 0.8 – 1 indican la reproducibilidad de cada escala entre evaluadores. A3 y B3. Heatmap de clase de severidad en 30 hojas evaluadas por escala y evaluador. El color representa el valor de la clase asignada por el evaluador para cada hoja. Por evaluador y hojas se traza un Hierarchical cluster analysis agrupado por el método ‘complete’ y distancia Euclidiana
Figura 3. Gráficos de correlación entre severidad (y) evaluada mediante escala y valores reales (x) de nueve evaluadores durante la Validación en Entorno Controlado (VEC) con 30 hojas de Phaseolus coccineus. Se ajusta la ecuación de regresión lineal (y = βo + βx + e) para determinar parámetros β, R2 y p-value mediante la función stat_poly_eq. Escalas logarítmicas-diagramáticas de A. 7 clases. B. 8 clases.
Figura 4. A1 y B1. Escala logarítmica-diagramática de 7 y 8 clases para evaluación de severidad de cenicilla en foliolos de frijol Ayocote (P. coccineus), durante el proceso de validación de 30 hojas en campo por cuatro evaluadores seleccionados. A2 y B2. Heatmap del coeficiente de correlación de Pearson (r) entre nueve evaluadores por escala de severidad. Los valores de r = 0.8 – 1 indican el nivel de reproducibilidad de cada escala entre evaluadores. A3 y B3. Heatmap de clase de severidad en 30 hojas evaluadas por escala y evaluador. El color representa el valor de la clase asignada por el evaluador para cada hoja. Por evaluador y hojas se traza un Hierarchical cluster analysis agrupado por el método ‘complete’ y distancia Euclidiana.
Figura 5. Gráficos de correlación entre severidad (y) evaluada mediante escala y valores reales (x) de nueve evaluadores durante la Validación en campo (VCa) con 30 hojas de Phaseolus coccineus. Se ajusta la ecuación de regresión lineal (y = βo + βx + e) para determinar parámetros β, R2 y p-value mediante la función stat_poly_eq. Escalas logarítmicas-diagramáticas de A. 7 clases. B. 8 clases
Figura 6. Estimación de indicadores de vigor y daño mediante imagen RGB (13 mpx) de Phantom 3 procesada mediante algoritmo supervisado de segmentación en ArcMap® v10.3. A1. Imagen del área total del experimento (40 x 52 m). Toma a 50 m altura. A2. Bloque de 15 cuadrantes seleccionados por uniformidad en continuidad de hospedero, vigor y máxima inductividad. En líneas continuas amarillas muestran división de cuadrantes. Líneas blancas discontinuas representan bloques seleccionados para representar estimación vía algoritmo versus imagen real. Toma a 27 m. A3. Imagen a 5 m de sector seleccionado para diseño de ‘firma RGB’ con categorías del cultivo (tejido foliar, floración, cenicilla y cobertura suelo).
Cuadro 1. Promedio de exactitud (β), precisión (R2) y reproducibilidad (r) de ocho escalas logarítmicas-diagramáticas de severidad para evaluar cenicilla en Phaseolus coccineus.
Cuadro 2. Comparación paramétrica de nueve evaluadores con respecto al valor real, para determinar exactitud (βx), precisión (R2) y nivel de concordancia (LCC, κw) por clase de severidad evaluada durante el proceso de validación en entorno controlado (VEC) y en campo (VCa).
Cuadro 3. Comparativo de índice de cobertura vigor (ICV), vigor de planta (ICP) y porcentaje de severidad de cenicilla, estimados con imagen RGB de dron y evaluaciones de campo
por Norma Ávila Alistac, Gustavo Mora Aguilera, Héctor Lozoya Saldaña, Erika J. Zamora Macorra, Camilo Hernández Juárez
Aceptado: 19/2/2024 – Publicado: 06/3/2024 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2311-2
Resumen Antecedentes/Objetivo. El objetivo fue analizar la variabilidad de dos aislados mexicanos de ToBRFV posterior a un proceso de inoculación y multiplicación en diferentes variedades comerciales y criollos mexicanos de jitomate (Solanum lycopersicum) (15 materiales) y chile (Capsicum annuum) (20 materiales), y evaluar la expresión de síntomas en condiciones de invernadero.
Materiales y Métodos. En invernadero, se analizó la variabilidad postinfección de dos aislados: EM-JI2021 (Edo. de México) y C-JI2021 (Colima) en 15 genotipos de jitomate y 20 de chile. Cada aislado se inoculó mecánicamente en cinco plantas por genotipo con un total de 150 plantas (56 días de edad) de jitomate y 200 de chile. Se emplearon tres plantas por genotipo como testigos. Sesenta y un días después de inoculación se colectó una hoja por planta para RT-PCR. Se registró incidencia y expresión de síntomas. La extracción de ARN fue por CTAB 2 %. Se utilizó oligos ToBRFV-F/ToBRFV-R que amplifican 475pb del gen RpRd (SENASICA-CNRF). Se secuenciaron 24 productos RT-PCR, se limpiaron y alinearon con registros del Genbank NCBI mediante MEGAv11.0.13. Con criterio epidemiológico, se seleccionaron 34 secuencias del GenBank para análisis de variabilidad.
Resultados. Diez días después de la inoculación, los genotipos de jitomate exhibieron mosaico severo, leve, reducción del área foliar. En chile se observaron síntomas diferenciados por genotipo, incluyendo reacción de hipersensibilidad, deformación foliar, necrosis en tallo, mosaico, amarillamiento, lesiones necróticas y condición asintomática. Entre la posición 2,124 al 2,500 pb se tuvo 99.74 % de homología con el primer reporte de ToBRFV en Jordania (KT383474.1). Se encontró homología >99.74 % con aislados de USA (MT002973.1) y Canadá (OQ674195.1). C-JI2021 no exhibió variabilidad, mientras que EM-JI2021 generó tres haplotipos: En Mulato (chile) y Don R (jitomate) se detectó cambio de un nucleótido (c.2,355T>C), mientras que en Santawest, Altius, Sahariana y Nebula (jitomate) se detectaron dos sustituciones (c.2,278A>T; c.2,355T>C).
Conclusión. La intensidad patogénica de ToBRFV varió de asintomática a severa según combinación de hospedero, genotipo y haplotipo. En periodos cortos de infección se detectaron tres haplotipos lo que sugiere capacidad mutagénica del virus en función del hospedero
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Figura 1. Síntomas en materiales comerciales y criollas de jitomate inoculados con Tomato brown rugose fruit virus. Síntomas de mosaico leve (IR143466, Nebula, Ametrino, Rio Grande, Citlali, Altius); mosaico severo, deformación y aclaramiento de nervaduras principales de la hoja (Volcano, Criollo-X y Angelle); planta sana (Angelle testigo)
Figura 2. Síntomas en chile (Capsicum annumm) inoculados con Tomato brown rugose fruit virus. A-C) Síntomas de deformación apical, necrosis en tallo y nervaduras en hojas de Almuden; D) Síntomas de deformación apical, ligera necrosis en nervaduras en Cayenne; E) Síntomas de deformación apical, mosaico, lesiones necróticas en hojas no inoculadas en Felicitas
Figura 3. Alineamiento de la secuencia parcial del gen de la replicasa del Tomato brown rugose fruit virus de 24 secuencias de aislados obtenidos de 35 genotipos inculados con los aislados EM-JI2021 y C-JI2021, y de 34 secuencias de diferentes países productores de jitomate y chile. Alineamiento realizado en Geneious
Cuadro 1. Secuencias completas de Tomato brown rugose fruit virus obtenidas del banco de genes (NCBI) utilizadas para el alineamiento y comparados con secuencias de ToBRFV de la investigación
Cuadro 2. Síntomas de Tomato brown rugose fruit virus en materiales comerciales y criollos de jitomate y chile expresados bajo condiciones de invernadero
Cuadro 3. Porcentaje de cobertura e identidad de dos aislados de ToBRFV inoculados en un total de 35 genotipos de jitomate y chile en condiciones de invernadero.
por Eric Ángel Mendoza Pérez, Ricardo Santillán Mendoza, Humberto Estrella Maldonado, Cristian Matilde Hernández, Felipe Roberto Flores de la Rosa, Jacel Adame García
Aceptado: 19/2/2024 – Publicado: 06/3/2024 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2307-6
Resumen Antecedentes/Objetivo. El limón persa (Citrus latifolia) muestra un nivel muy alto de tolerancia al Huanglongbing (HLB). Un estudio reciente sugiere que genes del complejo RPM1-RIN4-RPS2 podrían ser parte de los responsables de la tolerancia al HLB en el limón persa, a diferencia de otras especies muy susceptibles como la naranja (C. sinensis). El objetivo del presente trabajo fue comparar la expresión de este complejo génico entre la naranja, altamente susceptible al HLB, y el limón persa, una especie tolerante.
Materiales y Métodos. Se obtuvieron las secuencias de los tres genes del complejo para naranja y limón persa de bases de datos de trabajos previamente publicados, se realizaron alineamientos y diseño de iniciadores para expresión génica mediante diversas herramientas bioinformáticas. Posteriormente, se obtuvieron muestras de tejido de naranja y limón persa con síntomas de HLB y se corroboró la infección. Se realizó la comparación de la expresión de los genes RPM1-RIN4-RPS2 mediante RT-PCR punto final.
Resultados. Se determinó la presencia de los tres genes del complejo en naranja y limón persa, además, se determinó que están altamente conservados entre ambas especies. Además, se observó que no existe una expresión diferencial para el gen RPM1 en tejido sintomático de HLB, sin embargo, sí hay diferencia en la expresión de los genes RPS2 y RIN4.
Conclusión. Los resultados sugieren que la respuesta contrastante al HLB podría estar asociada a la actividad de la interacción de los genes RIN4 y RPS2, por lo cual, esta podría ser de interés para el mejoramiento genético de los cítricos en miras del control del HLB.
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Figura 1. Alineamiento de las secuencias de los genes CsRIN4 y ClRIN4
Figura 2. Síntomas de HLB presentes en hojas de limón persa (A) naranja Valencia (B) y frutos de limón persa (C) y naranja Valencia (D).
Figura 3. Expresión del complejo RPM1-RIN4-RPS2 mediante RT-PCR en naranja Valencia, especie altamente susceptible al HLB, y limón Persa especie con un alto nivel de tolerancia al HLB.
por Candelario Ortega Acosta, Reyna Isabel Rojas Martínez, Daniel L. Ochoa Martínez, Manuel Silva Valenzuela
Aceptado: 19/2/2024 – Publicado: 06/3/2024 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2310-2
Resumen Antecedentes/Objetivo. Los fitoplasmas son patógenos obligados de plantas, tienen una fuerte especificidad con sus hospedantes, los síntomas típicos inducidos por estos patógenos incluyen reducción de crecimiento y declinamiento generalizado, entre otros, y rara vez ocasionan muerte de la planta. El objetivo de esta investigación fue determinar el fitoplasma asociado al síntoma de ‘escoba de bruja’ en un cactus ornamental (Opuntia sp.).
Materiales y Métodos. En cuatro viveros comerciales en Texcoco, Estado de México, se tomaron cuatro muestras de cactus ornamental con síntomas de ‘escoba de bruja’. Se realizó extracción de ADN de las muestras y se sometieron a PCR con iniciadores específicos para fitoplasmas (P1/P7 y R16F2n/R16R2). La determinación del fitoplasma en estudio se realizó por PCR, RFLP in vitro, secuenciación y análisis filogenético.
Resultados. De acuerdo con los diferentes análisis que se realizaron, se determinó que el fitoplasma asociado al nopal ornamental pertenece al subgrupo 16SrII-C.
Conclusión. Con base en los resultados obtenidos, se establece que un fitoplasma del subgrupo16SrII-C está asociado con el síntoma de ‘escoba de bruja’ del cactus ornamental (Opuntia sp.).
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Figura 1. A) Amplificaciones de ADNr 16S de fitoplasmas obtenidos con los iniciadores R16F2n/R16R2. Carril M; Marcador molecular 100 pb, carril +; ADN proveniente de Dimorphotheca sinuata infectada con “Candidatus Phytoplasma asteris” (16SrI-B), carril -; Control negativo, PCR sin templete, carril 1-4; muestras de nopal (Opuntia sp.) con síntoma de ‘escoba de bruja’, proveniente de viveros ubicados en Texcoco, Estado De México; B-C) Síntomas de “escoba de bruja” en nopal ornamental.
Figura 2. Análisis RFLP del ADNr 16S de fitoplasmas amplificado con los iniciadores R16F2n/R16R2 y digeridos con cinco enzimas de restricción: EcoRI, HaeIII, KpnI, MseI y RsaI M: marcador molecular 100 pb (Promega, USA); A) Control positivo ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ (I-B); B) Muestra sintomática de nopal de este estudio (Número de acceso: 0N413680); C) Patrones de restricción in silico, generados a partir de las secuencias del gen DNAr 16S del Cactus witches’-broom phytoplasma 16SrII-C (Número de acceso: AJ293216.2) de los sitios de reconocimiento de 17 enzimas de restricción.
Cuadro 1. Árbol filogenético construido por el método de neighbor-joining con secuencias del ADNr 16S depositadas en el Banco de Genes, se muestra la relación entre los fitoplasmas del grupo 16SrI y 16SrII con el fitoplasmas que induce ‘escoba de bruja’ en nopal (Opuntia sp.) (Número de acceso: 0N413680.1). La barra indica el número de sustituciones por nucleótidos
por Lorena Uribe Lorío, Lidieth Uribe , César Rodríguez , Luis Felipe Aráuz
Aceptado: 05/1/2023 – Publicado: 26/2/2024 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2305-5
Resumen Antecedentes/Objetivo. El objetivo de este estudio fue evaluar la diversidad y resistencia a antibióticos de uso agrícola en bacterias aisladas de 19 cultivos con síntomas de infecciones bacterianas.
Materiales y Métodos. La colección de 116 bacterias se identificó mediante secuenciación del gen ARN 16Sr y el sistema Biolog, y se determinó la susceptibilidad y concentración mínima inhibitoria de la estreptomicina, tetraciclina y gentamicina utilizando la prueba de difusión en disco y E-test, respectivamente.
Resultados. Se identificaron 55 especies pertenecientes a 20 géneros bacterianos, destacando Pseudomonas, Serratia, Pantoea y Stenotrophomonas como los más abundantes. El 27 % de los aislamientos fue categorizado como patogénico mediante Reacción hipersensible, entre ellos los fitopatógenos Pseudomonas syringae, P. cichorii, Pantoea anthophila y P. stewartii, Stenotrophomonas maltophilia, Dickeya oryzae, Erwinia billingiae, Pectobacterium aroidearum, y Enterobacter cloacae subsp. dissolvens. Se observó resistencia a al menos un antibiótico en el 60 % de los aislamientos provenientes de 17 cultivos, aunque el tomate, palmito y lechuga presentaron la mayor proporción de bacterias resistentes (> 80 %). La resistencia a estreptomicina fue la más frecuente (35 %), seguida por tetraciclina (28 %) y gentamicina (9 %). Conclusiones. Los resultados muestran resistencia en bacterias saprófitas y patógenas asociadas a 17 de 19 cultivos evaluados, lo cual constituye un riesgo ambiental, fitosanitario y de salud pública
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Cuadro 3. Géneros bacterianos identificados y frecuencia de bacterias resistentes a los antibióticos Estreptomicina (Estr), Tetraciclina (Tetra) y Gentamicina (Gent).
Figura 1. Síntomas de infección bacteriana de los que fueron aisladas las bacterias de la colección analizada en este estudio. A. Mancha de la hoja en Lechuga Boston, B. Pudrición blanda en Lechuga Iceberg, C. mancha necrótica en Jitomate. D. Pudrición blanda en Apio. E. Pudrición blanda en Chile dulce. F. Pudrición blanda en Dracaena. G. Pudrición blanda en Zapallo. H. Necrosis angular en Repollo. L. Mancha del fruto en Mango
Figura 2. Cladograma construido con el método del vecino más cercano a partir de 70 secuencias parciales del gen ARNr 16S de bacterias aisladas de lesiones en plantas y secuencias de cepas de referencia. Se evaluó la topología del árbol realizando 1 000 remuestreos y se utilizó la secuencia de Bacillus subtilis como grupo externo. Los símbolos en el exterior del árbol indican los aislamientos clasificados como resistentes a Estreptomicina, Tetraciclina y Gentamicina y sus combinaciones (círculos) y aquellos con Reacción hipersensible positiva (triángulos)
Figura 3. A. Halos que demuestran la sensibilidad a los antibióticos en discos (Oxoid) de gentamicina y tetraciclina y resistencia a estreptomicina (ausencia de halo) en la prueba de difusión en disco Kirby Bauer. B. Bacteria con una CMI de 0.25 μg mL-1 para gentamicina, determinada por el método epsilométrico (E-test). C. Bacteria con una CMI de 32 μg mL-1 para el mismo antibiótico
Figura 4. Proporción de bacterias resistentes (CMI ≥ 12 μg mL-1) a los bactericidas Estreptomicina (Estr), Tetraciclina (Tet) y Gentamicina (Gent) y sus combinaciones en los hospederos analizados que presentaron más de un aislamiento
Cuadro 1. Diversidad y resistencia a antibióticos en bacterias asociadas a síntomas de infección bacteriana en cultivos de Costa Rica
Cuadro 2. Identificación y niveles de resistencia a estreptomicina, tetraciclina y gentamicina de aislamientos bacterianos pertenecientes a la colección de bacterias asociadas a síntomas de infección en cultivos colectados de 2006-2009 en Costa Rica
por María José Armenta Rojas, Norma Ávila Alistac, María del Carmen Zúñiga Romano, Gerardo Acevedo Sánchez, Alfonso Muñoz Alcalá, Rene Gómez Mercado, Juan José Coria Contreras, Diana Gutiérrez Esquivel, Serafín Cruz Izquierdo, Ivonne García González, Oscar Bibiano Nava, Gustavo Mora Aguilera
Aceptado: 25/12/2024 – Publicado: 12/2/2024 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2310-7
Resumen Introducción/Objetivo. El frijol Ayocote (Phaseolus coccineus) tiene potencial como fuente de resistencia en programas de fitomejoramiento al exhibir mayor tolerancia a fitopatógenos que P. vulgaris. Sin embargo, su caracterización sanitaria es insipiente por lo que este trabajo tuvo como propósito realizar un diagnóstico etiológico-epidemiológico, con énfasis en síntomas presuntivos a organismos virales y fitoplásmicos, y a signos fungosos típicos de cenicilla polvosa.
Materiales y Métodos. Se seleccionó una parcela (50 x 62 m) de frijol Ayocote en floración. Se dividió en 80 (8 x 10) cuadrantes (6 x 6 m) y 720 subcuadrantes (2 x 2 m). A partir de 25 plantas con síntomas foliares tipo cenicilla se colectó micelio con cinta adhesiva para observación en microscopia de luz e identificación taxonómica. Se realizaron mediciones longitud-ancho en 60 conidios. Micelio puro colectado in situ y ex situ de 1-5 foliolos / planta se empleó para análisis genómico mediante PCR con iniciadores universales ITS1 e ITS4. Las muestras se secuenciaron con Macrogen Inc. Corea. Un total de 63 plantas y 121 hojas-trifoliadas con síntomas tipo viral y fitoplásmico se colectaron mediante muestreo dirigido. En 88/121 muestras se realizó análisis genómico mediante PCR con iniciadores universales para Potyvirus (1), Begomovirus (2) y Fitoplasmas (1). La edición y análisis de secuencias se realizó en SeqAssem y BLASTn/GenBank. Construcciones filogenéticas se realizaron en Mega 11 con MUSCLE, Máxima verosimilitud (ML) y modelo de sustitución HKY (1000-Bootstrap). Severidad putativa a cenicilla (%), daño en flor (%), adultos de Macrodactylus sp. y vigor de planta (%) se evaluaron en 80 cuadrantes (3subcuadrantes/cuadrante) con App-Monitor®v1.1 configurada con escala de 5-clases. En GoldenSurfer® v10, se realizó análisis geoestadístico Kriging para determinar la interrelación espacial entre estas variables.
Resultados. Se identificó a Erysiphe vignae asociado a cenicilla de P. coccineus. El hongo, con conidios hialinos, ovoides a elipsoides de 31.74 ± 0.3419 μm x 15.11 ± 0.1579 μm, sin presencia de cuerpos de fibrosina, tuvo homología genómica del 100 %. Este constituye el primer reporte en México. Con temperatura y humedad relativa promedio julio-agosto de 16.3 °C (±5.8) y 92.8 % (±10.7), respectivamente, la cenicilla exhibió incidencia y severidad foliar de 65.3 y 22.7 % (±16.9, rango: 0 – 66.5 %), respectivamente. El foco más inductivo (60–80 % severidad) tuvo un patrón agregado de 4-cuadrantes (96 m2, lag = 4 y σ2-s = 450). La dispersión de inóculo se asoció significativamente con vientos dominantes Norte-Sur y con vigor de planta (lag = 4 y σ2-s = 470). Daño en flor no fue conclusivo en su asociación espacial con cenicilla y Macrodactylus sp., sugiriendo eventos no correlacionados. No se detectaron Potyvirus, Begomovirus o Fitoplasmas asociados a presuntivos síntomas tipo amarillamiento, distorsión foliar, mosaico, acortamiento de entrenudos, y otros observados in situ. Esto confirma la relativa tolerancia/resistencia reportada para P. coccineus.
Conclusión. Se reporta por primera vez en México a E. vignae (Erysiphales: Erysiphaceae) asociado a P. coccineus con niveles epidémicos de moderado a intenso, lo cual indica su condición susceptible a este hongo. Sin embargo, resultados negativos a Potyvirus, Begomovirus y Fitoplasmas, validan la aparente tolerancia/ resistencia de P. coccineus a estos organismos
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Figura 1. Muestreo para identificar y evaluar intensidad de síntomas fungosos, putativos virales/fitoplásmicos, y entomológicos en Phaseolus coccineus. A. Imagen de 13mpx 50m con drone Phantom 3 DJI®, muestra la cuadrantización de la parcela experimental. En líneas amarillas cuadrantes de 6x6 m, y en blanco subcuadrantes de 2x2 m. Asteriscos indican subcuadrantes/cuadrante seleccionados aleatoriamente; B. Instalación grid para delimitación de cuadrantes en campo; C. Selección de subcuadrante colocando marco de madera 1x1 m para referencia de evaluación; D. Síntomas de mosaico punteado (izquierda) y aclaramiento de nervaduras (derecha), putativos a virosis. Plantas marcadas con estacas para trazabilidad; E. Amarillamiento generalizado con reducción de crecimiento (izquierda), mosaico con deformación foliar (derecha) presuntivamente viral; F. Síntoma foliar con signo micelial fungoso blanquecino putativo a cenicilla; G. Haz de foliolo con signo micelial blanquecino. H. Macrodactylus sp. adultos, y color-morfología floral de P. coccineus. Notar en algunos pétalos manchas pequeñas blanquecinas (ver flechas).
Figura 2. Identificación morfológica y genómica de la cenicilla en frijol Ayocote (Phaseolus coccineus). A. conidios hialinos, ovoides a elipsoides; B-C. conidióforos cilíndricos y erectos; D-F. conidios en germinación; G. Amplificación de la región espaciadora interna transcrita (ITS) del ADN ribosómico nuclear (~500 pb) de cinco muestras de ADN de cenicilla (1-5), dos controles positivos de PCR (+) pertenecientes a la región ITS del género Alternaria y Fusarium, marcador de peso molecular (M) de 1 kb plus Invitrogen y control negativo de PCR (-); H. árbol filogenético realizado por Máxima verosimilitud (ML) y el modelo de sustitución Hasegawa-Kishino-Yano con 1000 replicaciones Bootstrap, basado en la región ITS de secuencias de hongos pertenecientes al género Erysiphe (Cuadro 2). Las secuencias de estudio son: FAC6, FAC7, FAC8 y FAC9 (punto rojo). Se incluyó a Oidium sp. (número de accesión: EU377475) como grupo externo
Figura 3. Síntomas en campo presuntivos a infección por fitoplasma en frijol Ayocote (Phaseolus coccineus). A. Síntomas putativos a fitoplasmas. Incluye deformación foliar, coloración café o violeta, con evidente coloración violáceas en nervaduras del envés de hojas jóvenes, achaparramiento, ligero amarillamiento foliar B. Ejemplo de seis hojas trifoliadas con síntomas presuntivos a fitoplasmas incluidas en diagnóstico PCR; C. Electroforesis en gel de agarosa de 24 muestras procesadas por PCR anidado. Únicamente los testigos positivos amplificaron por PCR
Figura 4. Mapas de contorno geoestadístico Kriging y variogramas gráficos de variables fitosanitarias y vigor en frijol Ayocote. A. Severidad de cenicilla, B. Daño en flor, C. Densidad de frailecillo (Macrodactylus sp.) y, D. Vigor de planta. Para el análisis de frailecillos se obtuvo la suma de tres subcuadrantes analizados por cuadrante. Para el análisis de severidad de cenicilla, daño de flor, y vigor de planta se consideró el daño máximo obtenido por cuadrante. Variogramas omnidireccionales se obtuvieron por el método esférico. Eje X = lag de distancia en cuadrantes y Y = la varianza (σ2)
Cuadro 1. Iniciadores, secuencias y tamaño de amplicon para la identificación genómica de Potyvirus, Begomovirus, Fitoplasmas y microorganismos eucariontes en plantas de P. coccineus con signos de hongo tipo cenicilla, y síntomas putativos a virus y fitoplasma
Cuadro 2. Secuencias obtenidas del banco de genes NCBI utilizadas para generar la estructura filogenética y comparar con secuencias de amplicones obtenidos de cuatro muestras del hongo tipo cenicilla presente en plantas de P. coccineus.
por Mauricio Montero Astúa, Izayana Sandoval Carvajal, Lisela Moreira Carmona, William Villalobos Muller, Laura Garita Salazar, Sofía Carvajal Rojas
Aceptado: 15/12/2023 – Publicado: 30/12/2023 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2023-3
Resumen Antecedentes/Objetivo. Las hojas del arbusto de chaya (Cnidoscolus aconitifolius) o árbol espinaca, o chicasquil (en Costa Rica), son parte de la tradición culinaria Mesoamericana, con origen en el sur de México y Guatemala. El objetivo de este trabajo fue verificar la naturaleza viral de la enfermedad de una planta de chaya con mosaico detectada e identificar la especie del virus.
Materiales y Métodos. La detección viral se realizó mediante TEM, RT-PCR y secuenciación parcial empleando imprimadores degenerados para potexvirus. Se realizaron pruebas de patogenicidad mediante inoculaciones mecánicas empleando plantas de Nicotiana benthamiana y de chaya.
Resultados. Se reporta la detección del CsCMV en una planta de chaya con síntomas de mosaico. La patogenicidad y asociación del virus con los síntomas se demostraron mediante su inoculación en Nicotiana benthamiana y en plantas de chaya. Nuestra hipótesis es que corresponde a una introducción reciente del virus y se discute cómo las tradiciones culturales influyen en la distribución de los virus de plantas.
Conclusión. Los hallazgos confirman la presencia de un virus relacionado al CsCMV, previamente no informado para Costa Rica, en Cnidoscolus aconitifolius. En este trabajo resaltan la necesidad de estudiar su distribución y diversidad a través de Latinoamérica
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Figura 1. Muestra de chaya (Cnidoscolus aconitifolius) 20.222, tentativamente var. ‘Estrella’, con síntomas de
Figura 2. Observaciones por microscopia electrónica de transmisión de tejido foliar de chaya (Cnidoscolus aconitifolius) con síntomas de mosaico detectada en Costa Rica. Daño observado en los cloroplastos (ch), con pérdida de su forma típica y de los tilacoides, además de una inclusión bandeada (IB), como las asociadas con potexvirus (A). Detalle de la IB (B). N: núcleo, V: vacuola
Figura 3. Phylogenetic analysis of partial replicase ORF (618 nucleotides) of Cassava common mosaic virus (CsCMV). Gray shaded isolates from chaya (Cnidoscolus aconitifolius) host; black shaded the Costa Rica chaya isolate, and in bold the sequence of CsCMV in cassava (Manihot esculenta) reported as from Costa Rica. Virus isolates codes: GenBank accession number, isolate identification and three-letter country codes. Maximum likelihood analysis with Tamura-Nei and Gamma distribution model with 2000 replications (bootstrap method) in MEGA X
Cuadro 1. Chaya (Cnidoscolus aconitifolius) samples evaluated for viral symptoms and sources of stem cuttings
por Erika J. Zamora Macorra, Katia Aviña Padilla, Rosemarie W Hammond, Daniel L. Ochoa Martínez
Aceptado: 24/11/2023 – Publicado: 23/12/2023 – DOI: https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2023-5
Resumen Antecedentes/Objetivo. El virus del fruto rugoso marrón del jitomate (ToBRFV) ha surgido como una amenaza significativa para los cultivos de la familia Solanaceae, incluidos el tomate y el pimiento. Su presencia en México desde 2018 ha generado preocupación sobre su impacto en la producción agrícola. La detección temprana y precisa de este patógeno es crucial para prevenir su propagación y mitigar sus efectos. En México, se emplean varias técnicas moleculares para su diagnóstico, incluyendo RT-PCR convencional, RT-qPCR y RT-qPCR multiplex.
Materiales y Métodos: El objetivo de esta investigación fue evaluar la eficiencia de diferentes métodos de extracción de ARN en combinación con oligonucléotidos PCR específicos para la detección de ToBRFV.
Resultados. Entre los métodos probados, el protocolo de extracción de ARN CTAB-Trizol combinado con PCR anidada utilizando oligonucleótidos reportados por Dovas et al. (2004) se identificó como el método molecular más sensible para detectar el virus.
Conclusión. Este hallazgo destaca la importancia de seleccionar la combinación adecuada de protocolos de extracción y amplificación para lograr la sensibilidad y precisión óptimas en la detección de ToBRFV. Palabras clave: Virus del fruto rugoso marrón del jitomate, ToBRFV, cultivos de Solanaceae, extracción de ARN, RT-PCR, detección molecular, producción agrícola.
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Figura 1. A-C) En plantas de jitomate saladette recolectadas en invernaderos, se observaron síntomas evidentes de mosaico, deformación foliar y estrechamiento de las hojas. Estas plantas dieron positivo para el virus del fruto rugoso marrón del jitomate (ToBRFV). D-E) Las observaciones visuales en hojas inoculadas de Nicotiana revelaron la presencia de lesiones cloróticas y necróticas localizadas causadas por la infección con ToBRFV. Las plantas utilizadas para el estudio y que resultaron positivas al virus provinieron de Tecomán, Colima, México.
Figura 2. La evaluación de los métodos de extracción de ARN total implicó la comparación de su eficacia y rendimiento, medidos a través de lecturas de absorbancia en un espectrofotómetro Nanodrop 2000®. De los métodos probados, que incluyeron Trizol®, CTAB 2 % y CTAB 2 %-Trizol®, el protocolo CTAB 2 %-Trizol® demostró producir la concentración más elevada de ARN total, mientras que el kit de aislamiento de ARN resultó en la concentración más baja. Estos datos fueron registrados mediante mediciones de absorbancia a longitudes de onda de 260/280 y 260/230. El Nanodrop 2000® se utilizó para cuantificar la concentración de ARN extraído y evaluar su calidad a través de estas relaciones de absorbancia. Los resultados señalan que el protocolo CTAB 2 %-Trizol® fue especialmente efectivo en la extracción de ARN de alta calidad de las muestras de plantas, lo que lo convierte en una opción adecuada para análisis moleculares posteriores
Figura 3. Evaluación y sensibilidad de los oligonucleótidos PCR. Análisis electroforético en geles de agarosa al 1.5 % de los productos de RT-PCR y RT-PCR anidada (tamaño esperado de los oligonucleótidos de Ling 842 pb; tamaño esperado de los oligonucleótidos de Rodríguez-Mendoza 475 pb; tamaño esperado de los oligonucleótidos de Dovas 400 pb). (-): agua esterilizada en lugar de ARN. 100pb= 100pb DNA Ladder (Invitrogen®). 1Kb= 1000 pb DNA ladder (Promega®). 10-3 y 10-4 = 0.001 y 0.0001 ng μL-1
Cuadro 1. Oligonucleótidos probados en este estudio para la detección del ToBRFV en jitomate, tomatillo y berenjena
Cuadro 2. Comparación de referencias de oligonucleótidos, fuentes vegetales y límites de detección de ARN en la fuente de material vegetal infectado.